本期為您推薦清華大學化工系生物育種技術與裝備團隊和江南大學糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心白仲虎團隊發(fā)表在代謝工程領域國際知名期刊 Metabolic Engineering 的文章：“CRISPRi-microfluidics screening enables genome-scale target identification for high-titer protein production and secretion”，論文通訊作者為清華大學張翀和江南大學劉秀霞。文章通過建立全基因組規(guī)模CRISPRi文庫，結合高通量的分泌蛋白表征技術和液滴微流控篩選平臺（DREM cell），在谷氨酸棒桿菌中繪制了蛋白分泌的基因型-表型關聯圖譜，系統地揭示了其基因組中能夠用于改善分泌蛋白生產的基因位點，并最終指導構建了高效分泌重組蛋白的底盤菌株。
Fig. 1. Schematic overview of the CRISPRi-microfluidics screen
谷氨酸棒桿菌因其安全（無內毒素）、高細胞密度培養(yǎng)和出色的蛋白質分泌能力，已廣泛應用于重組藥物蛋白的生產。全基因組規(guī)模評價有望指導高產重組蛋白的微生物細胞工廠構建，但由于不僅需要全面的基因型干擾，還需要高通量表型篩選策略，仍存在挑戰(zhàn)。
在這項研究中，研究團隊構建了谷氨酸棒桿菌基因組規(guī)模的CRISPRi文庫，并開發(fā)了基于雙砷-四半胱氨酸反應和皮升級液滴微流控分選平臺（DREM cell）的重組蛋白高通量篩選模型，通量可達到>105個單細胞/天。
Fig. 2. Procedure for screening high-producing strains in microfluidic droplets
以納米抗體VHH作為模式分泌蛋白，使用建立的模型對文庫中超過50萬個單細胞進行高通量篩選，通過多輪篩選富集了大量高產菌株。許多以前未知的基因被確定為在多種細胞過程中發(fā)揮作用的有益靶點，包括跨膜轉運、氨基酸代謝和氧化還原調節(jié)。通過氧還轉錄因子 CosR 和 RshA 的組合敲除獲得了VHH產量提高2.78倍的底盤菌株。
由于 CRISPR 技術和基于雙砷-四半胱氨酸反應的液滴微流控篩選平臺的普適性，該研究中的“CRISPRi-微流控篩選”平臺未來或被廣泛應用于各種原核宿主和不同蛋白的分析，助力下一代微生物蛋白細胞工廠的創(chuàng)制。
Fig. 3. FlAsH-driven FADS-enriched high-producing strains
Fig. 4. Genome-wide identification of beneficial gene targets for the production/secretion of r-proteins
論文鏈接:
https://doi.org/10.1016/j.ymben.2022.12.004
本期為您推薦清華大學化工系生物育種技術與裝備團隊和江南大學糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心白仲虎團隊發(fā)表在代謝工程領域國際知名期刊 Metabolic Engineering 的文章：“CRISPRi-microfluidics screening enables genome-scale target identification for high-titer protein production and secretion”，論文通訊作者為清華大學張翀和江南大學劉秀霞。文章通過建立全基因組規(guī)模CRISPRi文庫，結合高通量的分泌蛋白表征技術和液滴微流控篩選平臺（DREM cell），在谷氨酸棒桿菌中繪制了蛋白分泌的基因型-表型關聯圖譜，系統地揭示了其基因組中能夠用于改善分泌蛋白生產的基因位點，并最終指導構建了高效分泌重組蛋白的底盤菌株。
Fig. 1. Schematic overview of the CRISPRi-microfluidics screen
谷氨酸棒桿菌因其安全（無內毒素）、高細胞密度培養(yǎng)和出色的蛋白質分泌能力，已廣泛應用于重組藥物蛋白的生產。全基因組規(guī)模評價有望指導高產重組蛋白的微生物細胞工廠構建，但由于不僅需要全面的基因型干擾，還需要高通量表型篩選策略，仍存在挑戰(zhàn)。
在這項研究中，研究團隊構建了谷氨酸棒桿菌基因組規(guī)模的CRISPRi文庫，并開發(fā)了基于雙砷-四半胱氨酸反應和皮升級液滴微流控分選平臺（DREM cell）的重組蛋白高通量篩選模型，通量可達到>105個單細胞/天。
Fig. 2. Procedure for screening high-producing strains in microfluidic droplets
以納米抗體VHH作為模式分泌蛋白，使用建立的模型對文庫中超過50萬個單細胞進行高通量篩選，通過多輪篩選富集了大量高產菌株。許多以前未知的基因被確定為在多種細胞過程中發(fā)揮作用的有益靶點，包括跨膜轉運、氨基酸代謝和氧化還原調節(jié)。通過氧還轉錄因子 CosR 和 RshA 的組合敲除獲得了VHH產量提高2.78倍的底盤菌株。
由于 CRISPR 技術和基于雙砷-四半胱氨酸反應的液滴微流控篩選平臺的普適性，該研究中的“CRISPRi-微流控篩選”平臺未來或被廣泛應用于各種原核宿主和不同蛋白的分析，助力下一代微生物蛋白細胞工廠的創(chuàng)制。
Fig. 3. FlAsH-driven FADS-enriched high-producing strains
Fig. 4. Genome-wide identification of beneficial gene targets for the production/secretion of r-proteins
論文鏈接:
https://doi.org/10.1016/j.ymben.2022.12.004
