研究背景：

       液滴微流控，作為近年來發(fā)展起來的一種高通量檢測(cè)篩選技術(shù)，因其低成本，超高通量等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用用酶定向進(jìn)化、抗體開發(fā)、高產(chǎn)菌株篩選等領(lǐng)域。熒光激活的液滴分選是目前主流的微流控篩選方法，而多色熒光檢測(cè)，為更加靈活的選擇熒光標(biāo)簽，構(gòu)建更加復(fù)雜的多參數(shù)熒光體系，提供了重要支持。

       本實(shí)驗(yàn)通過將綠色和紅色熒光微球混合后進(jìn)行液滴包裹，然后對(duì)液滴進(jìn)行雙激光同時(shí)激發(fā)和檢測(cè)，獲得微球在液滴內(nèi)包裹狀態(tài)的數(shù)據(jù)，從而驗(yàn)證DREM cell平臺(tái)對(duì)多色熒光檢測(cè)和篩選的功能適用性，為相關(guān)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)過程：

       1、樣品處理：將綠色熒光微球（λex=488nm；λem=520nm；粒徑5um）和紅色熒光微球（λex=620nm；λem=680nm；粒徑5um）濃度調(diào)整為5x10^6/ml；按照1：1的比例將兩者混勻；

       2、使用液滴微流控細(xì)胞分選儀（DREM cell）將上述樣品包裹進(jìn)微液滴，分別采集520nm通道（PMT3）、670nm通道（PMT1）的熒光信號(hào)，對(duì)目標(biāo)液滴群體圈門后，進(jìn)行分選；DREM cell儀器的使用流程如下所示：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

       1、分別采集520nm通道（PMT3）、670nm通道（PMT1）的信號(hào)，在兩個(gè)通道的實(shí)時(shí)信號(hào)圖中，能夠?qū)芯G色熒光微球，含有紅色微球，以及共包裹有紅色熒光微球和綠色熒光微球的液滴進(jìn)行識(shí)別和區(qū)分；

       2、在二維散點(diǎn)圖中，分別對(duì)P1、P2、P3液滴群體進(jìn)行圈門，分選，對(duì)收集到的液滴進(jìn)行鏡檢觀察，如下圖：P1群體分選得到的為紅色熒光微球，P2群體分選得到的為綠色熒光微球，P3群體分選得到的為共包裹紅色熒光微球和綠色熒光微球的液滴，符合預(yù)期；

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

       本實(shí)驗(yàn)利用天木生物開發(fā)的液滴微流控細(xì)胞分選儀（DREM cell），對(duì)混合含有紅色熒光微球的液滴、綠色熒光微球的液滴、以及共包裹兩種微球的液滴進(jìn)行了識(shí)別和區(qū)分，并根據(jù)雙熒光檢測(cè)通道的信號(hào)進(jìn)行了圈門，成功對(duì)混合液滴中的三類液滴群體進(jìn)行了篩選，表明了系統(tǒng)分選的準(zhǔn)確性。

應(yīng)用展望：

       對(duì)于目標(biāo)樣品的多種不同熒光信號(hào)的同時(shí)檢測(cè)和分析在高通量篩選研究中具有重要作用，如多功能酶進(jìn)化研究、蛋白互作研究、免疫細(xì)胞篩選研究、多種熒光PCR研究，抗體篩選等，其中酶進(jìn)化研究的典型案例如下圖所示：

       該研究通過使用兩種不同熒光標(biāo)記的底物，實(shí)現(xiàn)了對(duì)布洛芬酯酶的立體選擇性這一復(fù)雜性狀的改造，經(jīng)過五輪的突變和篩選，得到的最優(yōu)突變體對(duì)S-布洛芬底物的選擇性提升了700倍（DOI: 10.1038/s41467-018-03492-6）