? ? ? 近日，中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院、海洋食品加工與安全控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室薛長(zhǎng)湖院士團(tuán)隊(duì)課題組的研究成果“Silkworm cocoon-like nanocoatings for single-cell encapsulation of probiotics:Construction,mechanism and characterization”在《Food Bioscience 》期刊上發(fā)表。
? ? ? 本研究以植物乳桿菌（L. plantarum）為模型，首次結(jié)合全自動(dòng)高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（Microbial Microdroplet Culture system ， MMC），在pH 3.0-6.0條件下篩選多糖/蛋白材料：羧甲基殼聚糖 （CMCS）、殼寡糖 （COS）、支鏈淀粉 （AP） 和果膠 （PE） 四種多糖，以及明膠 （GE）、乳清分離蛋白 （WPI）、卵清蛋白 （OVA） 和大豆分離蛋白 （SPI） 四種蛋白質(zhì)等，構(gòu)建厚度為100-150 nm的蠶繭狀涂層。通過(guò)MMC實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)涂層對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響，隨后，通過(guò)傅里葉變換紅外光譜（FTIR）等分析表明，靜電相互作用、氫鍵和疏水相互作用是涂層與植物乳桿菌之間的主要驅(qū)動(dòng)力。此外，COS 涂層促進(jìn)了植物乳桿菌的生長(zhǎng)和繁殖，而 CMCS 和 OVA 則抑制了植物乳桿菌的生長(zhǎng)和繁殖。最后，COS 、 WPI 和 GE 涂層作為屏障都提高了植物乳桿菌在巴氏殺菌、凍融循環(huán)和貯藏條件下的存活率。其中，COS 作為一種海洋低聚糖，由于其優(yōu)異的性能和形成的致密涂層，對(duì)植物乳桿菌的保護(hù)效果最好。
一、研究背景
1.益生菌
益生菌通過(guò)定植腸道調(diào)節(jié)菌群，改善免疫、代謝疾病及胃腸道功能，但其在加工、儲(chǔ)存中易受溫度、pH等環(huán)境脅迫失活。
2.封裝技術(shù)
傳統(tǒng)多細(xì)胞封裝存在顆粒大、效率低等問(wèn)題，而單細(xì)胞封裝可直接遞送活性益生菌至靶點(diǎn)，同時(shí)減少對(duì)食品感官的影響。
3.封裝材料
可食用蛋白（如WPI、GE）和多糖（如CMCS、COS）因生物相容性、安全性及功能多樣性成為理想包材，但其在益生菌封裝中的應(yīng)用機(jī)制尚不明確。
二、方法與技術(shù)平臺(tái)
1.材料篩選
本研究同時(shí)測(cè)試了8種涂層材料，包括四種多糖 (CMCS、COS、AP和PE) 以及四種蛋白質(zhì) (GE、WPI、OVA和SPI) 作為包衣材料。篩選結(jié)果顯示，PE和SPI都不能在植物乳桿菌表面形成涂層，選擇CMCS、COS、AP、GE、WPI和OVA等6種材料作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的涂層材料。
考慮到酸性環(huán)境不利于植物乳桿菌的生長(zhǎng)，而在pH 5.0和pH 6.0下，大多數(shù)涂層材料攜帶相對(duì)較少的正電荷并且不能通過(guò)靜電相互作用與植物乳桿菌很好地結(jié)合。因此，pH 4.0被選為最合適的制劑研究其余部分的環(huán)境。
2.高通量評(píng)估涂層生物相容性
為了更好地驗(yàn)證在pH 4.0條件下不同材料的包封效果，本研究采用了全自動(dòng)高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（MMC），MMC具備連續(xù)監(jiān)測(cè)能力，可精準(zhǔn)捕捉涂層對(duì)菌體不同生長(zhǎng)階段的調(diào)控（如延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期）。通過(guò)MMC自動(dòng)生成實(shí)時(shí)生長(zhǎng)曲線（每30分鐘記錄OD600值，持續(xù)14小時(shí)），根據(jù)生長(zhǎng)曲線的結(jié)果選擇合適的涂層材料進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果如圖所示，PL@GE、PL@WPI和PL@AP的生長(zhǎng)與游離L. plantaurum的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異；GE、WPI和AP涂層的存在不會(huì)影響植物乳桿菌的正常生長(zhǎng)和增殖。而PL@COS的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于游離的植物乳桿菌，推測(cè)歸因于COS在改善腸道有益菌增殖方面的作用。相反，PL@CMCS 和PL@OVA的生長(zhǎng)比游離L. plantaurum差。因此在接下來(lái)的研究中，選擇WPI、GE、COS和AP作為下一階段實(shí)驗(yàn)的涂層材料。
3.涂層-菌體動(dòng)態(tài)互作機(jī)制解析
本研究設(shè)計(jì)了一種類(lèi)似蠶繭結(jié)構(gòu)的納米涂層，旨在通過(guò)這種結(jié)構(gòu)為益生菌提供保護(hù)。該涂層能夠有效保護(hù)益生菌免受胃酸、膽汁鹽以及消化酶等胃腸道內(nèi)環(huán)境的不利影響。
通過(guò)電熒光顯微鏡和TEM進(jìn)一步證實(shí)了納米涂層的存在和蠶繭狀結(jié)構(gòu)。此外，傅里葉變換紅外光譜（FTIR） 分析顯示，靜電吸引、氫鍵和疏水相互作用參與PL@CMCS、PL@COS、PL@GE、PL@WPI和 PL@OVA的形成，而PL@AP的形成僅包括氫鍵和疏水鍵相互作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)COS涂層可以促進(jìn)植物乳桿菌的生長(zhǎng)，而CMCS和OVA涂層對(duì)植物乳桿菌具有抑制作用。
結(jié)果表明，涂層對(duì)植物乳桿菌凍融穩(wěn)定性的提高程度依次為COS、AP、GE、WPI。多糖涂層對(duì)植物乳桿菌凍融穩(wěn)定性的影響優(yōu)于蛋白質(zhì)涂層，因?yàn)槎嗵蔷哂泻軓?qiáng)的持水能力，可以阻礙水分遷移。這四種涂層作為物理屏障可以有效地隔離不利的環(huán)境條件。
其中，COS涂層對(duì)提高植物乳桿菌在4℃下的貯藏穩(wěn)定性效果最好。以COS為代表的功能性低聚糖不僅可以作為抵抗不利外界環(huán)境的物理屏障，還可以作為益生元進(jìn)一步擴(kuò)大功能性低聚糖的應(yīng)用范圍。COS作為一種涂料具有阻隔和益生元的雙重性能，比其他涂料具有更好的保護(hù)作用。
這是第一篇研究不同包膜材料和pH值對(duì)蠶繭狀納米包膜植物乳桿菌制備的影響，并闡明了包膜形成機(jī)制的論文。所得結(jié)果將為新型包衣益生菌的開(kāi)發(fā)及其在功能食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。、
關(guān)于MMC
關(guān)于天木生物
天木生物專(zhuān)注于生物育種領(lǐng)域的高端儀器裝備的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，致力于通過(guò)高效的突變技術(shù)和高通量篩選技術(shù)，改造提升產(chǎn)業(yè)傳統(tǒng)菌種開(kāi)發(fā)模式，為生物制造產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效，提升我國(guó)生物產(chǎn)業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力。?
?致力于為行業(yè)“細(xì)胞和菌種開(kāi)發(fā)與篩選效率低”、“相關(guān)裝備成本昂貴”、“產(chǎn)業(yè)化落地困難”等難題提供優(yōu)秀的解決方案。
? ? ? 近日，中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院、海洋食品加工與安全控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室薛長(zhǎng)湖院士團(tuán)隊(duì)課題組的研究成果“Silkworm cocoon-like nanocoatings for single-cell encapsulation of probiotics:Construction,mechanism and characterization”在《Food Bioscience 》期刊上發(fā)表。
? ? ? 本研究以植物乳桿菌（L. plantarum）為模型，首次結(jié)合全自動(dòng)高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（Microbial Microdroplet Culture system ， MMC），在pH 3.0-6.0條件下篩選多糖/蛋白材料：羧甲基殼聚糖 （CMCS）、殼寡糖 （COS）、支鏈淀粉 （AP） 和果膠 （PE） 四種多糖，以及明膠 （GE）、乳清分離蛋白 （WPI）、卵清蛋白 （OVA） 和大豆分離蛋白 （SPI） 四種蛋白質(zhì)等，構(gòu)建厚度為100-150 nm的蠶繭狀涂層。通過(guò)MMC實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)涂層對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響，隨后，通過(guò)傅里葉變換紅外光譜（FTIR）等分析表明，靜電相互作用、氫鍵和疏水相互作用是涂層與植物乳桿菌之間的主要驅(qū)動(dòng)力。此外，COS 涂層促進(jìn)了植物乳桿菌的生長(zhǎng)和繁殖，而 CMCS 和 OVA 則抑制了植物乳桿菌的生長(zhǎng)和繁殖。最后，COS 、 WPI 和 GE 涂層作為屏障都提高了植物乳桿菌在巴氏殺菌、凍融循環(huán)和貯藏條件下的存活率。其中，COS 作為一種海洋低聚糖，由于其優(yōu)異的性能和形成的致密涂層，對(duì)植物乳桿菌的保護(hù)效果最好。
一、研究背景
1.益生菌
益生菌通過(guò)定植腸道調(diào)節(jié)菌群，改善免疫、代謝疾病及胃腸道功能，但其在加工、儲(chǔ)存中易受溫度、pH等環(huán)境脅迫失活。
2.封裝技術(shù)
傳統(tǒng)多細(xì)胞封裝存在顆粒大、效率低等問(wèn)題，而單細(xì)胞封裝可直接遞送活性益生菌至靶點(diǎn)，同時(shí)減少對(duì)食品感官的影響。
3.封裝材料
可食用蛋白（如WPI、GE）和多糖（如CMCS、COS）因生物相容性、安全性及功能多樣性成為理想包材，但其在益生菌封裝中的應(yīng)用機(jī)制尚不明確。
二、方法與技術(shù)平臺(tái)
1.材料篩選
本研究同時(shí)測(cè)試了8種涂層材料，包括四種多糖 (CMCS、COS、AP和PE) 以及四種蛋白質(zhì) (GE、WPI、OVA和SPI) 作為包衣材料。篩選結(jié)果顯示，PE和SPI都不能在植物乳桿菌表面形成涂層，選擇CMCS、COS、AP、GE、WPI和OVA等6種材料作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的涂層材料。
考慮到酸性環(huán)境不利于植物乳桿菌的生長(zhǎng)，而在pH 5.0和pH 6.0下，大多數(shù)涂層材料攜帶相對(duì)較少的正電荷并且不能通過(guò)靜電相互作用與植物乳桿菌很好地結(jié)合。因此，pH 4.0被選為最合適的制劑研究其余部分的環(huán)境。
2.高通量評(píng)估涂層生物相容性
為了更好地驗(yàn)證在pH 4.0條件下不同材料的包封效果，本研究采用了全自動(dòng)高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（MMC），MMC具備連續(xù)監(jiān)測(cè)能力，可精準(zhǔn)捕捉涂層對(duì)菌體不同生長(zhǎng)階段的調(diào)控（如延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期）。通過(guò)MMC自動(dòng)生成實(shí)時(shí)生長(zhǎng)曲線（每30分鐘記錄OD600值，持續(xù)14小時(shí)），根據(jù)生長(zhǎng)曲線的結(jié)果選擇合適的涂層材料進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果如圖所示，PL@GE、PL@WPI和PL@AP的生長(zhǎng)與游離L. plantaurum的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異；GE、WPI和AP涂層的存在不會(huì)影響植物乳桿菌的正常生長(zhǎng)和增殖。而PL@COS的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于游離的植物乳桿菌，推測(cè)歸因于COS在改善腸道有益菌增殖方面的作用。相反，PL@CMCS 和PL@OVA的生長(zhǎng)比游離L. plantaurum差。因此在接下來(lái)的研究中，選擇WPI、GE、COS和AP作為下一階段實(shí)驗(yàn)的涂層材料。
3.涂層-菌體動(dòng)態(tài)互作機(jī)制解析
本研究設(shè)計(jì)了一種類(lèi)似蠶繭結(jié)構(gòu)的納米涂層，旨在通過(guò)這種結(jié)構(gòu)為益生菌提供保護(hù)。該涂層能夠有效保護(hù)益生菌免受胃酸、膽汁鹽以及消化酶等胃腸道內(nèi)環(huán)境的不利影響。
通過(guò)電熒光顯微鏡和TEM進(jìn)一步證實(shí)了納米涂層的存在和蠶繭狀結(jié)構(gòu)。此外，傅里葉變換紅外光譜（FTIR） 分析顯示，靜電吸引、氫鍵和疏水相互作用參與PL@CMCS、PL@COS、PL@GE、PL@WPI和 PL@OVA的形成，而PL@AP的形成僅包括氫鍵和疏水鍵相互作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)COS涂層可以促進(jìn)植物乳桿菌的生長(zhǎng)，而CMCS和OVA涂層對(duì)植物乳桿菌具有抑制作用。
結(jié)果表明，涂層對(duì)植物乳桿菌凍融穩(wěn)定性的提高程度依次為COS、AP、GE、WPI。多糖涂層對(duì)植物乳桿菌凍融穩(wěn)定性的影響優(yōu)于蛋白質(zhì)涂層，因?yàn)槎嗵蔷哂泻軓?qiáng)的持水能力，可以阻礙水分遷移。這四種涂層作為物理屏障可以有效地隔離不利的環(huán)境條件。
其中，COS涂層對(duì)提高植物乳桿菌在4℃下的貯藏穩(wěn)定性效果最好。以COS為代表的功能性低聚糖不僅可以作為抵抗不利外界環(huán)境的物理屏障，還可以作為益生元進(jìn)一步擴(kuò)大功能性低聚糖的應(yīng)用范圍。COS作為一種涂料具有阻隔和益生元的雙重性能，比其他涂料具有更好的保護(hù)作用。
這是第一篇研究不同包膜材料和pH值對(duì)蠶繭狀納米包膜植物乳桿菌制備的影響，并闡明了包膜形成機(jī)制的論文。所得結(jié)果將為新型包衣益生菌的開(kāi)發(fā)及其在功能食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。、
關(guān)于MMC
關(guān)于天木生物
天木生物專(zhuān)注于生物育種領(lǐng)域的高端儀器裝備的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，致力于通過(guò)高效的突變技術(shù)和高通量篩選技術(shù)，改造提升產(chǎn)業(yè)傳統(tǒng)菌種開(kāi)發(fā)模式，為生物制造產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效，提升我國(guó)生物產(chǎn)業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力。?
?致力于為行業(yè)“細(xì)胞和菌種開(kāi)發(fā)與篩選效率低”、“相關(guān)裝備成本昂貴”、“產(chǎn)業(yè)化落地困難”等難題提供優(yōu)秀的解決方案。
